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                          免疫組化IHC小白入門攻略,CST中國教你一步步搞定免疫組化

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                        1. TA的每日心情

                          2019-1-23 15:22
                        2. 簽到天數: 1 天

                          [LV.1]初來乍到

                          跳轉到指定樓層
                          樓主
                          發表于 2019-4-1 16:15:46 | 只看該作者 回帖獎勵 |倒序瀏覽 |閱讀模式
                          禁毒吧-中國禁毒網站戒毒論壇
                            免疫組化(IHC)不是什么新鮮事,早在上個世紀七十年代,便已有人使用這項技術。近年來,隨著‘無圖無真相,王道即真理’觀念的強化,越來越多的研究使用這項古老且神秘的技術檢測組織標本中特定蛋白的表達和分布,使科學假想與體內環境有機結合,讓科學論文的質量得以升華。
                            
                            
                            
                            CST賽信通關于免疫組化mTOR Signaling信號通路圖
                            
                            以下內容有些燒腦,不過看過之后,你就對免疫組化(IHC)有個大致了解了。
                            
                            免疫組化(IHC)簡而言之,統共分成七步:脫蠟/復水,抗原修復,淬滅(去除內源性過氧化物酶),封閉,抗體孵育及DAB顯色。前三步形似泡澡堂,后三步形似Western blot。
                            
                            泡澡之前,我們得脫衣服,脫蠟就是給石蠟切片“脫衣服”的過程,即,用二甲苯將石蠟從切片上“脫”下來,總共脫3次,每次5min。在進澡堂子之前,我們得穿上澡堂提供的浴袍,讓自己融入澡堂的環境。復水的目的就是利用乙醇的雙溶性,使得切片跟后續的水溶性實驗體系相容。這一步中,我們使用100%乙醇和95%乙醇各洗切片2次,每次10min。
                            
                            接下來,我們就能進入免疫組化(IHC)中極為重要的一步——泡澡,哦不,是抗原修復了。抗原修復的目的是將抗原表位得以暴露,使得后續的一抗可以結合上去。目前而言,抗原修復的方式主要分為熱修復和酶修復兩種,其中熱修復是在微波爐或者高壓鍋中,切片在沸騰溫度(95-99℃)加熱一段時間后完成,所用到的修復液主要有檸檬酸緩沖液(pH=6.0),EDTA(pH=8.0)和TE(pH=9.0)三種;酶修復則是在37℃溫箱中進行,利用胃蛋白酶、胰蛋白酶或者蛋白酶K進行的酶解作用達到抗原修復的目的,使用這種修復方式需注意對修復液進行預熱,使其在切片放入前,就已達到酶類的最佳反應溫度。
                            
                            抗原修復是免疫組化(IHC)中最重要的一環,目的蛋白抗原表位的修復效果影響著后續的一抗結合效果,即影響著最終的結果。在實驗開始前,仔細閱讀抗體說明書,查看其推薦的修復條件。跟泡澡體驗相似的是,人太多體驗感就差,同理,在修復時不要貪多貪快,微波爐中一次只修復一缸,并根據容器體積,加入其推薦的修復液的量(CST中國的推薦用量為250ml)。
                            
                            此外為了保證實驗具有良好的重復性,CST中國推薦使用濃縮修復液,這不僅簡化了實驗準備工作,而且使實驗批次間所使用的修復液組分達到更佳的穩定性。
                            
                            
                            
                            在上述大事完成后,我們進行的是免疫組化(IHC)特色項目——淬滅(即去除內源性過氧化物酶)。目前絕大多數免疫組化(IHC)都是基于HRP檢測系統,所以我們需要去除組織中內源性過氧化物酶的活性。只需在3%H2O2中浸泡10min即可。
                            
                            此時的切片,便形似一張濕轉后的western blot膜——方方的載體上分布著我們的蛋白。
                            
                            為了減少二抗與組織的非特異結合,我們需使用二抗來源的血清進行封閉。由于CST的絕大多數一抗為鼠抗(mouse)和兔抗(rabbit),對應的二抗來源于羊(goat),所以我們使用5%正常羊血清(溶劑為TBST),將其滴加到組織上,室溫封閉1h即可。
                            
                            我們也可以使用CST新推出的不含動物組分的封閉液(Animal-FreeBlocking Solution (5X) #15019),以達到更佳、更具實驗穩定性的封閉效果。
                            
                            擦去封閉液后(后方的同志注意了,不是洗去!不是洗去!不是洗去!),如同western blot一樣,我們可以進行一抗孵育。一抗的特異性對染色結果有著至關重要的作用。正所謂抗體選不好,Figure有煩惱;抗體一跑偏,結果就坑爹。為了提高實驗的成功率及可信度,一定要選擇經過周(dì)密(yù)嚴(mó)格(shì)驗證的高(C)大(S)上(T)抗體,并根據說明書的提示,使用特定的稀釋體系配置抗體工作液。
                            
                            敷有一抗的切片在4℃過夜并經洗滌后,進行二抗孵育。二抗的效力及其與一抗的契合度也影響著染色結果。CST開發出了具有高靈敏度的二抗,可以與一抗成為融洽的soulmate。
                            
                            
                            
                            二抗孵育并洗滌后,將新鮮配置的DAB顯色液滴加至切片上,進行顯色反應,即棕黃色顆粒的形成。在顯色過程中,需對切片嚴密監控以控制合適的顯色程度(一般1-10min),當獲得合適的染色強度后,將切片浸泡于dH2O中,終止顯色。
                            
                            
                            
                            顯色結束后,可以根據實驗需要進行核復染。核復染可以凸顯細胞結構,并有利于結果的觀察和判讀。目前,多數研究者使用的核復染試劑為蘇木精(Hematoxylin #14166),將細胞核染成藍色。
                            
                            最后,對切片進行脫水、封片(DAB顯色系統,可使用中性樹膠)。就能在顯微鏡下細細端詳品讀實驗結果啦。CST中國推薦的抗體試劑:
                            
                            
                            
                            
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